Wako MagCaptureTM 外泌體提取試劑盒常見問題與技術

Wako MagCaptureTM 外泌體提取試劑盒常見問題與技術

MagCaptureTM 外泌體提取試劑盒

常見問題? 關于試劑盒的規范、性能

Q1 本試劑盒使用了抗體?

A1 沒有使用抗體。使用了與金屬離子結合和與磷脂酰絲氨酸(PS)結合的蛋白。

 

Q2 用此款試劑盒可提取什么樣胞外囊泡呢?

A2 外泌體和大型細胞外囊泡(微小泡)。

Q3 外泌體和微泡的區別是?

A3 外泌體,是來源于晚期胞內體,直徑為40-100nm的細胞外囊泡。微泡來源于細胞膜,直徑100-1000nm的細

胞外囊泡。

 

Q4 外泌體和微泡能可以分別純化嗎?

A4 可以。同時純化的情況下,1200×g離心取上清液。純化外泌體的情況下,10000×g離心取上清液。只純化微

泡的情況下,10000×g離心,沉淀置于TBS制成懸濁液備用。樣品的前處理請參考操作說明書。

 

Q5 外殼型病毒也能回收嗎?

A5 能。外殼性病毒膜表面也有PS,混入外殼性病毒的樣品,所有PS都能回收。需要分離的情況下,使用本試劑盒

回收后,需要用與病毒或者外泌體特異性抗原的抗體純化。

 

Q6 所有的外泌體都會暴露磷脂酰絲氨酸(PS嗎?

A6 尚未得到實驗驗證。通過分析外泌體的膜脂成分證實,有幾種細胞(小鼠少突膠質細胞)來源于外泌體。因

此,不會暴露PS。另一方面有可能存在少量PS暴露的外泌體,而此款試劑不能純化這種外泌體。但是,使用

該試劑純化到的外泌體,已確認有多個外泌體標記蛋白,與以單一類型的表面標記蛋白作為抗原的傳統親和方

法相比,以膜脂成分為抗原的該試劑能取得更多種類的外泌體。另外,雖然識別表面標記蛋白的抗體可能無法

識別不同動物來源的抗原,但是該試劑能解決這一問題(人類、小鼠、牛等都能應用)。而且已驗證了可以純

化超速離心時需沉淀才能回收的外泌體。

 

Q7 該試劑盒的品是什?

A7 使用細胞培養上層清液、血清或尿液效果顯著。如果血漿中添加了螯合劑(比如EDTA)和檸檬酸,原理上無

法分離外泌體。若要回收,可通過超濾更換緩沖液來回收。具體步驟請看相關資料。由于肝素處理過的血漿回

? ? ? ? 收率低,從血液樣本中回收請使用血清。另外有客戶成功從血漿、腦脊髓液中回收外泌體。

 

Q8 一次能回收多少外泌體?

A8 根據樣品的種類和數量有很大的差異,據研究所實驗記錄,在一次的分離中最多能回收30μg蛋白質(通過

BCA法檢測)、1-2×1010粒子(通過納米技術檢測)。(K562培養基中的莫能菌素能促進外泌體分泌,可取

5mL培養上清液進行回收)。

1 mL正常人混合血清能回收5×109顆粒(通過納米技術檢測)。

 

? 與傳統法的比較

Q9 與超速離心法相比好處在哪?

A9 與超速離心法相比,本試劑盒能更簡便、重復性好、高效地回收高純度外泌體。也能回收超速離心法無法沉淀

的外泌體。

 

Q10 與傳統抗體親和法相比,PS親和的優勢是什么?

A10 采用傳統的抗體親和法是用變性劑進行洗脫,此款試劑盒是在中性環境下用螯合劑來洗脫的,能完整回收外

泌體,不會混入非特異性吸附物,能獲得高純度外泌體,提取純度更高。傳統的抗體親和法只能特異性識別

一種外泌體表面Marker蛋白質,而本試劑盒是特異性識別膜脂質成分,更能廣泛獲得外泌體。有事例表明識

別表面Marker蛋白質抗體不能識別不同動物物種的抗原,而本試劑盒能在大范圍的動物物種中運用(人,

小鼠,牛等都有報道)。

 

Q11 與其他方法相比回收的度如何?

A11 與傳統沉淀法(超速離心法、多聚物沉淀法)相比,純度更高。與超速離心法和密度梯度離心法相結合的方

法相比,能簡便地獲得同等高純度的外泌體。(原因:采用抗體的傳統親和法是用變性劑進行洗脫,因此很

容易混入粒子等非特異性吸附物。然而此款試劑盒是用螯合劑來洗脫的,所以難以混入非特異性吸附物。)

 

Q12 與其他方法相比回收率如何?

A12 與采用抗體的傳統親和法、超速離心法相比,能獲得更高的回收率(低于聚合物沉淀法)。

 

? 關于試劑盒的操作方法、組成

Q13 操作該試劑盒耗多久?

A13?。?個小時預處理樣品),該試劑盒Exosome Capture 磁珠的固定需要15分鐘,然后3個小時的化學反應,

最后15分鐘洗脫,總計3小時30分鐘。

 

Q14 本試劑盒需要特別慎重的操作嗎?

A14 Exosome Capture 固定化磁珠與樣品反應后的清洗步驟中最后需要去除洗凈液。完全去除后再進行提取。

提取時在提取液中加入磁珠后,確保磁珠不發生凝集并處于懸浮狀態。

 

Q15 提取液的組成有哪些?

A15 是含有1mM 的螯合劑、鹽、防腐劑的Tris基礎溶液。若以上成分阻礙后續分析,請使用超速離心膜

(Sartorius公司? VivaSpin500,使用100K分子量截留,Code:VS0141)并替換合適的Buffer。

 

Q16 Exosome Capture 固定后磁珠可以循環利用嗎?

A16 可以。為了能夠高效回收樣品中的外泌體,試劑盒可完成5次回收實驗。試劑盒里的緩沖液只含5次純化的

量。1mL體積以上樣本建議進行濃縮后再回收,純化時可進行反復抽提,提高純化效率。詳情參考操作說

明書。

 

Q17 Exosome Capture 固定化磁珠能保存嗎?

A17 可以。洗脫出外泌體后的磁珠需再使用,用試劑盒附帶的 Washing buffer 或自制的TBS冷藏保存。

 

Q18 實驗要留到第二天需要做什么步驟?

A18 Exosome Capture 固定化磁珠與樣品的反應步驟(反應時間3小時)可以過夜(置于4℃下)。

 

? 關于樣品用量

Q19 樣品純化所需的最低量是?

A19 使用旋轉器的需要500μL以上,使用離心管混合器的需要100μL。樣品量更少的情況下加TBS到所需最低量后

再使用Exosome Capture 固定化磁珠。

 

Q20 大量的樣品能回收嗎?

A20 可濃縮后再回收。如果樣品是培養上清,可以從體積50毫升的樣品中回收外泌體。離心分離預處理后,取

50mL上清液超離濃縮至1mL(推薦Sartorius Viva Spin20 使用100K分子量截留、Code:VS2041)。無

血清培養基和添加了10% FBS的培養基也可以收集外泌體。詳情參照操作說明書。因為血清樣品無法濃縮,

最多只能用10mL的樣品。但是大于1mL的血清回收率低,建議反復提純。

 

? 關于外泌體提取后的分析

Q21 外泌體中含有什么?

A21 含有蛋白質、脂質、核酸(DNA、microRNA、mRNA)等。

 

Q22 提取后的胞外囊泡可以用什方法檢測?

A22 因為能得到完整的細胞外囊泡,可以使用所有的分析方法。

(例)蛋白質分析:蛋白質電泳、免疫印跡、質譜分析、流式細胞術、ELISA等

核酸分析如:定量PCR、微陣列(生物芯片)、新一代測序等

粒子分析:電鏡分析,納米位點分析(NTA)等

功能分析:體內外的用藥實驗等

 

Q23 提取后的細胞外囊泡(EVs)能直接添加到細胞使用中嗎?

A23 可以使用,但有需要注意的地方。如果提取液的成分有影響,參考Q15替換合適的Buffer。使用離心過濾

部件。

(Millipore 公司ΜLtrafree – MC, GV 0.22μm 已滅菌、Code:UFC30GV0S)除菌。

 

Q24 電鏡分析需要外泌體的量是多少?

A24 能用電鏡觀察到2-4×1010的粒子(通過納米技術檢測)。

 

Q25 提取出的細胞外囊泡的保存條件是?

A25 冷藏、冷凍保存。長期保存需要放到-80℃。

為避免凍結溶解,凍結保存推薦細分后保存。

 

Q26 如何做回收的外泌體提取液的免疫印跡?

A26 本公司研究所從回收的100 μL提取液抽取15 μL,加入5 μL 4×SDS樣品Buffer,共20μL的樣品全量上樣進行

SDS-PAGE。用量與宣傳冊上的免疫印跡的樣本量一致。

Q27 Exosome質譜檢測的步驟是?

A27 外泌體提取→SDS-PAGE與膠內酶切→通過LC-MC/MS進行蛋白質組學分析

 

 

? 關于外泌體標記

Q28 用該試劑盒提取出來的囊泡怎判斷是外泌體呢?

A28 根據表面抗原的抗體(WB)、電子顯微鏡、密度梯度離心、納米粒度測量(如NanoSight LM10)等來

驗證。

Q29 外泌體分離后用免疫印跡法確標記蛋白是什么?

A29 CD9, CD63, CD81, Frotillin-2, Lamp-1等。

 

? 相關產品

Q30 有在售和光檢測外泌體用的抗體?

A30 本公司當前銷售以下抗體。

Anti CD9 for Exosome Isolation(Cosmo Bio Cat. NO.CAC-SHI-EXO-M01-50UL

Anti CD81 for Exosome Isolation(Cosmo Bio Cat. NO.CAC-SHI-EXO-M03-50UL

Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13)(Wako Cat. NO.012-27063

Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13)(Wako Cat. NO.016-27061

 

Q31 有可以從分離囊泡里提RNA試劑?

A31 有??墒褂?a target="_blank" rel="noopener">microRNA Extractor SP Kit(295-71701)比AGPC法更能高效提純RNA。

 

Q32 售磁支架嗎?

A32 有的。Wako品牌,產品編號290-35591,MagCapture系列磁珠捕獲用磁力架?!?/p>

?

Q33 該技術專利是什么?

A33 已申請PCT專利。

Q34 加入什么金屬離子?

A34 鈣離子

?

Q35 血漿提取方法是?

A35 請查看相關資料。

Q36 試劑盒中的22支反應管有什么特殊之處嗎?用普通的1.5mL離心管可以嗎?

A36 該試劑盒中的反應管使用特殊材質,可減少磁珠吸附,該反應管可單賣

A36 BMBio BM-15 Ring Lock Tube 1.7mL 500 tubes/box 1。

參考文獻

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